哺乳动物精子发生是一个高度复杂且受到严实调控的细胞发育过程。该过程包含三个最基本的生物学事件：有丝分裂、减数分裂和精子形成。在有丝分裂过程中，精原细胞资历自我更新、增殖和分化，保证了精子发生的合手续性和踏实性；在减数分裂过程中，发生同源染色体的精确配对、重组交换与精确分离，在保证遗传踏实性的基础上产生了配子遗传物资的高度千般性；在精子形成过程中，则发生了顶体形成、组卵白-鱼精卵白转化、核浓缩和包装重建等一系列复杂的细胞生物学和形态学变化，使精子细胞具备了引导和受精潜能。上述过程中生密致胞类型的千般性和生物学事件的高度复杂性决定了精子发生是连络基因抒发调控的绝佳模子。 

        关联词，经过数十年的深切连络，咫尺对哺乳动物精子发生的连络仍然存在着很多制约身分。举例，咫尺尚未有高效和浅薄的生密致胞体外培养体系，况兼由于数十类生密致胞和多种体细胞同期存在于睾丸组织当中，要获取高纯度的、处于特定发育阶段的各级生密致胞是极其贫窭的。因此，现时对精子发期许制的连络多经受的是对类型羼杂的群体细胞的系综平均连络，而非对单个性细胞告成进行系统连络。这也就导致遥远以来咱们对哺乳动物精子发生的调控机制短少一个系统全面的意会。

        2018年7月30日，海外著明学术期刊《Cell Research》在线发表了北京大学BIOPIC中心、北京异日基因会诊高精尖翻新中心汤富酬课题组与中国科学院生去世学与细胞生物学连络所童明汉课题组、李劲松课题组团结的题为Single-cell RNA-seq Uncovers Dynamic Processes and Critical Regulators in Mouse Spermatogenesis的最新连络后果。该职责始创性地将精子发生同步化智商与生殖细胞特异性荧光记号相结合，分离获取了高纯度的处于不同发育阶段的小鼠生密致胞，并应用高精度单细胞转录组测序的智商，树立了小鼠精子发生过程的转录组密致图谱。该职责系统揭示了精子发生过程中基因抒发调控的动态变化，筛选、考据了不同发育阶段的要害调控因子，说明了不同发育阶段精子细胞与卵细胞结合后产生的胚胎具有不同的发育潜能，并系统地追想了精子发生过程中RNA可变剪接的动态变化、减数分裂性染色体失活（MSCI）等多种要害生物学事件的中枢法例。

1. 精子发生同步化智商得回高纯度各级生密致胞的策略

        精子发生是一个一语气且非同步化的过程，弘扬为生精上皮的细胞组合存在周期性变化，沿生精小管纵轴标的的不同位置处于不同的生精上皮周期。睾丸内生密致胞类型的复杂性则源于生精上皮周期性开释的维甲酸信号——维甲酸为精原细胞分化的必需因子，精原细胞分化的不同步形成了不同生精上皮内生殖细胞组合的千般性。

        基于精原细胞分化的机理，该连络通过对重生小鼠一语气7天饲喂维甲酸合成通路的扼制剂WIN 18，446，使精子发生顽固于未分化型精原细胞阶段，在第8天通过腹腔打针维甲酸，使精原细胞同步分化。由于分化后的细胞周期相对固定且同步，通过对维甲酸惩办不同时刻点的小鼠系列取材，可得回不同发育阶段的生密致胞。而未分化型精原细胞不受同步化的影响，为了幸免其耻辱，该连络构建了生密致胞特异性佩带红色荧光卵白（Vasa-dTomato）的基因敲入小鼠模子和未分化型精原细胞特异性佩带黄色荧光卵白（Lin28-YFP）的基因敲入小鼠模子。红色单阳性的细胞即为同步化的辩论细胞，不错通过单细胞采集系统Unipick得回单个细胞或FACS分选汇集辩论细胞群体。基于上述智商，该连络分离并武断了20类处于精子发生不同期期的细胞类型（图1），并愚弄高精度单细胞转录组测序的智商树立了上述不同发育阶段的转录组详备图谱。

图1：连络经过表露图及该连络中的20种生密致胞类型

2. 生密致胞转录组的动态变化

        通过对20个阶段的1，204个生密致胞进行高精度单细胞转录组测序，经过严格的质地截止后，剩余1，136个细胞用于后续的分析。基因抒发数量扫尾浮现，在统统这个词精子发生过程中，生密致胞需要转换基因组近90%（20，088个基因中的18，037个）的卵白质编码基因的抒发（图2a）；与此同期，各阶段生密致胞转录水平存在显着的动态变化。其中晚粗线期与双线期精母细胞达到统统这个词精子发生过程的转录峰值，而在晚细线前期与细线期阶段则为转录低谷期（图2a）。聚类扫尾浮现，20类生密致胞不错辩认为7大类。真理的是，同处于DNA复制的早细线前期与中晚期细线前期精母细胞被聚类到了不同的类群之中（C1与C2）（图2b），领导早细线前期（ePL）向中晚期细线前期（mPL）的升沉可能是减数分裂过程潜在的进击障碍点；同为圆形精子细胞的RS2（C5）、RS4与RS6（C6）和RS8（C7）则被分为三群，领导其功能可能存在显赫各别。

图2：（a）箱式图展示了20个阶段的生密致胞中已知卵白质编码基因的基因数量；（b）t-SNE分析将生密致胞辩认为C1至C7共7个新类群

3. 精子发生过程中要害调控因子的筛选与考据

参与减数分裂过程的新基因

        减数分裂是生殖细胞所特有的生物学事件，是生物有性生殖的基础。在此过程中，同源染色体的非姐妹染色单体间发生配对、联会和重组交换，从而使配子呈现遗传千般化，增多了后代的相宜性。如斯复杂的生物学过程需要盛大因子的共同谐和，而在此之前已知的调控因子并不全面，有待进一步挖掘和陈诉。

        该连络通过系统的生物信息学的分析发现了与减数分裂重组过程关系的进击基因，包括Prdm9、Gm960、Meiob等，它们均特异抒发于细线期或偶线期精母细胞内。与此同期，还发现了一些未知基因，包括Fbxo47、Pparg、Ccnb3等也弘扬出通常的抒发模式。领导这些未知基因可能在减数分裂重组过程中阐扬要害调控作用。

        于是该连络遴荐了Fbxo47基因开展进一步的功能考据，此前的报说念合计Fbxo47基因和东说念主类癌症关系，关联词其具体功能还是未知。该连络构建了Fbxo47的条目性基因敲除小鼠，功能连络发现生密致胞内特异性失活Fbxo47基因的小鼠弘扬为雄性不育。睾丸切片H&E染色扫尾浮现，Fbxo47基因敲除的成年小鼠的精子发生顽固于生精上皮的第Ⅳ期，同期发生多半精母细胞凋一火的快乐（图3a）。免疫荧光染色扫尾进一步浮现，Fbxo47基因敲除的成年小鼠生精上皮内莫得粗线期精母细胞及后续细胞类型，弘扬为减数分裂前期I停滞（图3b）。上述扫尾进一步说明了该连络树立的精子发生过程转录组密致图谱在筛选参与特定生物学事件的潜在调控因子的可靠性。

图 3：（a）8周龄野生型小鼠睾丸和Fbxo47基因敲除小鼠睾丸切片的H&E染色扫尾；（b）8周龄野生型小鼠和Fbxo47基因敲除小鼠睾丸切片的免疫荧光染色扫尾。标尺：50 μm

精子发生过程中进击的转录因子

        精子发生过程具有很强的阶段特异性，在不同阶段中有着不同的转录特征，而转录因子被合计是在精子发生过程中调理了基因抒发的时空特异性。

        为了寻找调控精子发生要害升沉节点的转录因子，该连络分别分析了有丝分裂向减数分裂升沉过程和减数分裂向精子形成升沉过程中的转录因子共抒发调控蚁集。共抒发蚁集扫尾浮现，c-fos/c-jun和Zfp316在有丝分裂向减数分裂升沉过程中具有潜在的调控作用（图4a）。而在减数分裂向精子形成升沉过程中，除已报说念的在生密致胞发育过程中阐扬着进击功能的Crem和Rfx2外，该连络还筛选出像Sox30和Zfp541这么未知的潜在转录因子（图4b）。

图 4：有丝分裂向减数分裂升沉（a）及减数分裂向精子形成升沉（b）过程中的转录因子共抒发调控蚁集。其中，黄色圆点表露各个转录因子，连线表露转录因子之间的关联

        为了考据这些未知转录因子的作用，该连络对小鼠进行了Sox30基因的全局性敲除或生殖细胞特异性敲除。功能连络发现岂论是全局性敲除的小鼠如故条目性敲除的小鼠，齐弘扬为雄性不育。组织学H&E染色发现，Sox30基因敲除小鼠的精子发生弘扬为精子形成贫窭，生精上皮内莫得长形精子，极少的圆形精子细胞纠合形成多核巨型细胞。通过对顶体的染色，发现Sox30基因敲除小鼠的精子发生顽固于圆形精子形成的第3~4步，领导Sox30基因在调控精子形成中的要害作用（图5a）。

        为了探究Sox30调控精子形成的机制，连络东说念主员从Sox30条目性基因敲除小鼠中获取了49个第3步圆形精子细胞用于单细胞转录组分析。Sox30基因敲除组和野生型对照组细胞内基因抒发各别显着，存在两千多个各别抒发基因（1，153个突变组下调基因和895个突变组上调基因）。通过对各别抒发基因作念GO分析发现，Sox30基因敲除组下调的基因与精子形成密切关系。为了进一步寻找受Sox30告成调控的卑鄙靶基因，该连络开展了SOX30的ChIP-seq施行。通过与RNA-Seq的扫尾共同分析，在基因敲除组下调的基因中找到233个受Sox30告成调控的要害靶基因。通过GO分析发现，这些靶基因与精子形成密切关系，举例Chd5， Hils1和Sun5等（图5b）。

图 5：Sox30基因敲除防碍了小鼠精子细胞的发育。（a）8周龄条目性敲除小鼠（Sox30-cKO）和对照组小鼠（control）的睾丸组织切片H&E染色和荧光染色扫尾，其中PNA标志着精子细胞的顶体；（b）野生型、条目性敲除、全局性敲除小鼠在3个代表性基因上ChIP-seq的扫尾。比例：50 μm

4. 第1~2步圆形精子相较于第7~8步圆形精子受精产生的胚胎具有较低的发育潜能

        基于该连络树立的各级生密致胞的高精度转录组数据，连络东说念主员筛选获取了特异性抒发于不同发育阶段圆形精子的名义标志物，包括Cd37、Cd63、Cd96和Cd177等（图6a）。流式细胞分选实考据实了CD63阴性大略得胜地富集第7~8步的晚期圆形精子细胞；而CD63强阳性则大略富集第1~2步的早期圆形精子细胞。这一施行扫尾提供了一种愚弄名义标志物分离获取不同发育阶段圆形精子细胞的策略。

        为了不雅察不同发育阶段的圆形精子细胞是否与其授精后胚胎发育潜能关系，该连络进一步通过同步化智商及名义标志物分选的智商分别获取了早期圆形精子细胞和晚期圆形精子细胞，应用胞质圆形精子打针（Intracytoplasmic Round Spermatid Injection，ROSI）实考据实了晚期圆形精子细胞打针所得胚胎发育至囊胚的比率显赫高于早期圆形精子细胞打针所得胚胎（图6b）。因此，第1~2步圆形精子相较于第7~8步圆形精子与卵细胞结合后产生的胚胎具有较低的发育潜能；领导东说念主类临床上和动物施行上较低的ROSI得胜率很可能是因为使用的圆形精子细胞中很大一部分是早期圆形精子而导致的。淌若大略使用上述新发现的名义标志物将晚期圆形精子特异性富集出来用于ROSI，将有可能大幅度进步其得胜率。

图 6：第1~2步圆形精子相较于第7~8步圆形精子具有较低的胚胎发育潜能

5. 精子发生过程中可变剪接的动态变化

        在精子发生过程中会存在着多半的可变剪履新件。该连络通过对来自精子发生13个要害阶段的66个单细胞进行全长RNA-seq测序，扫尾发现可变事件在各阶段生密致胞内的踱步情况与基因抒发数辩论动态变化极为相似，领导了可变剪接伴跟着转录过程，是精子发生过程中转录后调控的进击弘扬面目（图7a）。同期，在该连络中还发当今各个阶段的生密致胞中，内含子淹留（intron retention）和外显子特出（exon-exon junction）类型的可变剪履新件遥远是占比最高的可变剪接类型。

图 7：（a）柱状图展示了不同精子发生阶段中，每个细胞中至少含有2种可变事件的基因的平均数量；（b）堆积柱状图展示了相邻阶段各别基因和可变变化之间的关系

        为了连络在相邻阶段之间发生变化的可变剪履新件，该连络将每个阶段的单细胞团结在沿途，然后再行蓄意了每个阶段的可变剪接情况。扫尾发现，淌若仅沟通两个阶段中至少有一个阶段存在可变剪接的情况，不错显着看到内含子保留是占比最高的可变剪接变化，这也就领导内含子保留可能是参与生密致胞转录后调控的进击妙技之一。

        为了不雅察可变剪接和基因抒发之间的具体关系，该连络分析了相邻阶段之间各别基因的可变剪接变化。扫尾发现，当生密致胞从前一个阶段过渡到下一个阶段时，上调的各别基因更倾向于保留内含子而扼制抒发，此时对应的RNA就会先储存起来而不进行卵白质翻译。关联词，下调的各别基因则更多的是升沉为剪接熟谙的转录本，这么的活动是成心于浅显翻译使用的（图7b）。

6. 性染色体基因抒发的动态变化

        在精子发生过程中，性染色体上的基因有其独到的抒发现象，即会发生减数分裂性染色体千里默（Meiotic Sex Chromosome Inactivation，MSCI）快乐。关联词由于受细胞纯度问题的困扰，对该快乐的意会过甚发期许制的连络一直不够深切。

        该连络通过详备相比不同发育阶段生密致胞内性染色体基因抒发的水平，详备归纳了不同基因的抒发情况，并将这些基因辩认红了MSCI PMSC、MSCI escape PMSC、escape MSCI等（图8a）。其中PMSC（Post Meiotic Sex Chromosome Inactivation）指的是减数分裂后性染色体关系基因不激活的气象，已有的不雅念合计，性染色体上基因在完成减数分裂后，仍旧处于转录扼制气象，此种快乐称之为PMSC。同期，在该连络中发现不同性染色体基因的不同抒发模式与其功能是密切关系的，举例escape MSCI的基因功能与染色质的重塑密切关系，领导这些基因可能参与了精子形成过程（图8b）。

图 8：（a）热图展示了MSCI-PMSC、MSCI-逃跑PMSC、逃跑MSCI、RS特异性共5种类型的性染色体上基因在精子发生过程中的抒发变化；（b）逃跑MSCI基因的GO富集分析扫尾

        综上，该职责通过将精子发生同步化本领与单细胞转录组测序本领奥妙地结合起来，绘画了一幅高精度的小鼠精子发生转录组图谱，全面揭示了小鼠精子发生过程中基因抒发的高度动态性与时空特异性，并在此基础上对发现的要害候选基因通过基因敲除和告成卑鄙靶基因检测（ChIP-seq）等策略进行了深切的功能和机理连络，为后续全面连络精子发生调控机制提供了表面基础和顾惜资源，并对临床男性生殖贫窭的诊疗提供了表面率领，为最终陈诉哺乳动物精子发生的分子调控机制提供了可能路线。

        北京大学北京异日基因会诊高精尖翻新中心博士生郑宇轩和高云、中国科学院生去世学与细胞生物学连络所博士后陈瑶、博士生林震和杨苏明为该著作并排第一作家，北京大学汤富酬耕种、中国科学院生去世学与细胞生物学连络所童明汉连络员和李劲松连络员为该著作的共同通信作家。此项职责得到了中国科学院政策性先导科技专项、科技部（973筹备）、国度重心研发筹备、上海生科院基金、国度当然科学基金、上海市科委、北京异日基因会诊高精尖翻新中心的相沿。

        原文联接：https://www.nature.com/articles/s41422-018-0074-y暗网人兽

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